青春期是復(fù)雜的性發(fā)育生物學(xué)過程，受到遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境和社會經(jīng)濟(jì)因素的影響。下丘腦脈沖式GnRH分泌的激活是青春期開始的重要事件。在青春期成熟過程中，下丘腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是GnRH釋放的關(guān)鍵，然后垂體分泌促性腺激素和性腺類固醇生成。

    性早熟定義為在女孩8歲、男孩9歲前出現(xiàn)第二性征。引起性早熟的病因有多種，其中最重要的是區(qū)分中樞性（促性腺激素依賴型性早熟）和非促性腺激素依賴型性早熟。中樞性性早熟由下丘腦-垂體-性腺軸過早激活所引起，大多為女孩。而且大部分病例為特發(fā)性。但是，已知遺傳因素對青春期開始時間具有基礎(chǔ)作用，如同相同種族成員以及母親-女兒、同卵雙生子和同胞對有類似的初潮年齡。最近，de Vries et al.報告，家族性中樞性性早熟有27.5%的發(fā)生率，在這些家庭的分離分析提示了性別依賴性不完全外顯率的常染色體顯性傳遞。

    已經(jīng)提出，吻肽-GPR54信號發(fā)放復(fù)合體是GnRH神經(jīng)元和生殖軸青春期激活的?#30475;門人?#65292;在家族性或散發(fā)性單純促性腺激素不足性腺機能減退癥已經(jīng)鑒別出GPR54的功能損失點突變或缺失。此外，Gpr-54敲除小鼠有類似的性成熟障礙。在本研究中，我們假設(shè)人GPR54受體功能增強點突變可能與GnRH釋放過早激活相關(guān)，導(dǎo)致中樞性性早熟。

案例報告

    到圣保羅醫(yī)院發(fā)育內(nèi)分泌科就診的一名8歲收養(yǎng)女孩。出生后乳房過早發(fā)育并緩慢進(jìn)展，在7歲時乳房發(fā)育加速，可見陰毛，病人的病例一般，無神經(jīng)病學(xué)癥狀；也無其它，例如痤瘡、油性皮膚、腋毛和月經(jīng)等青春期征兆；也無咖啡牛乳色斑。在8歲時，該女孩身高131.5cm、體重26.7kg，無父母身高中值。乳房發(fā)育為Tanner等級4、陰毛Tanner等級2，骨齡11歲（依Greulich和Pyle法）

    基礎(chǔ)黃體生成素（LH）水平小于0.6IU/L（青春期前正常水平<0.6 到 0.7 IU/L），基礎(chǔ)促卵泡激素（FSH）為2.6IU/L（青春期前正常水平<1.0 到 7.2 IU/L）。此外，在GnRH刺激后的LH和FSH分別為6.4 IU/L 和5.9 IU/L(青春期后典型的LH水平, >6.9 IU /L)，LH/FSH峰值比例1.08。在注射醋酸亮丙瑞林后2小時LH水平為8.5 IU/L (青春期后的典型水平, >10 IU/L)。血清雌二醇水平為22pg/ml(80 pmol/L, 正常青春期前水平, <13 pg/ml [47pmol/L])。

    骨盆超聲檢查顯示無腫塊，相對于生活年齡來說卵巢和子宮體積增大（右卵巢4.4m³，左卵巢3.6m³，子宮5.4cm³）。中樞神經(jīng)系統(tǒng)磁共振成像正常。

    盡管基礎(chǔ)LH水平在青春期前正常范圍內(nèi)，GnRH刺激的LH也并非促性腺激素依賴性性早熟診斷數(shù)值，無原發(fā)性卵巢紊亂或神經(jīng)性疾病癥狀支持診斷為特發(fā)性中樞性性早熟。因此，開始以GnRH類似物治療（3.75mg/月醋酸亮丙瑞林），持續(xù)4年。中樞性性早熟被滿意的治療反應(yīng)所證實，包括乳房發(fā)育部分消退（到Tanner等級3），生長速度下降，骨成熟停滯，卵巢大小下降和促性腺激素的抑制，雌二醇恢復(fù)到青春期前水平。在12歲時自發(fā)出現(xiàn)初潮，然后有規(guī)律的月經(jīng)。病人的成年身高152.2cm。

方法

DNA分析

    醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)了DNA分析方法，由該病人和53名無關(guān)的特發(fā)性性早熟兒童的父母，以及150名同種族成年對照組得到知情同意書，所有兒童均口頭同意。由外周血液白血球提取基因組DNA，在自動測序儀上進(jìn)行GPR54 全編碼區(qū)域和外顯子-內(nèi)含子邊界的擴增分析。

通過定點突變方法產(chǎn)生Arg386Pro GPR54

    在體外，由定點突變方法生成Arg386Pro GPR54。使用QuikChange II定點突變試劑盒和含有全長野生人GPR54的哺乳動物表達(dá)載體pCMVsport6作為模板。通過直接測序我們證實了突變的存在。

GPR54信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究

    應(yīng)用GenePORTER 轉(zhuǎn)染試劑(基因治療方法)，以50ng的野生型 GPR54, Arg386Pro GPR54或空載體(pCMVsport6)使非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞(COS-7 細(xì)胞)瞬時轉(zhuǎn)染。在增加吻肽（kisspeptin）刺激后，在不同點上測量調(diào)解細(xì)胞外信號的激酶的肌醇磷酸和磷酸化作用。

結(jié)果

DNA分析

    病人基因組的GPR54自動測序顯示，在外顯子5的核苷酸1157位點上鳥嘌呤被胞嘧啶雜合取代，導(dǎo)致受體羧基末端密碼子386 (Arg386Pro)的精氨酸被脯氨酸替代（圖1）。Arg386Pro的突變產(chǎn)生了被SmaI所識別的限制性酶切位點；在150名青春期發(fā)育正常的同種族對照組的300條染色體、53名（女50，男3）無關(guān)的特發(fā)性中樞性性早熟兒童的106條染色體篩查，均未發(fā)現(xiàn)Arg386Pro的突變。

Arg386Pro GPR54的功能分析

    在以¹²⁵I標(biāo)記的吻肽孵育野生型或Arg386Pro GPR54轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞所進(jìn)行的結(jié)合研究顯示，氨基酸替代對吻肽的結(jié)合親和力或GPR54表達(dá)水平（野生型GPR54的離解常數(shù)為4.4nM; Arg386Pro GPR54為7.0nM;二者的最大結(jié)合能力為20nmol/ml蛋白）無顯著影響。

    以野生型GPR54、Arg386Pro GPR54轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的基礎(chǔ)肌醇磷酸水平無顯著性差異。而且劑量反應(yīng)曲線或野生型GPR54與Arg386Pro GPR54對吻肽濃度增加(吻肽由10^–11到10^–7 M)的最大反應(yīng)不存在顯著不同（圖2A）。引起野生型GPR54和Arg386Pro GPR54達(dá)到各自基線與最大反應(yīng)之間一半的反應(yīng)時，吻肽的濃度分別為0.23和0.28nM，肌醇磷酸的最大活性分別為每分鐘每ug蛋白78.4和77.8。時間過程分析表明野生型和Arg386Pro GPR54在2小時肌醇磷酸水平達(dá)到高峰，但此后，以Arg386Pro GPR54轉(zhuǎn)染的細(xì)胞肌醇磷酸水平的下降速度較慢，導(dǎo)致吻肽刺激18小時后顯著較高的肌醇磷酸水平（圖2B）。當(dāng)野生型和Arg386Pro GPR54二者轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞時，這種效應(yīng)同樣明顯。

    為了證實突變受體長時間的作用過程，我們測量了對吻肽刺激反應(yīng)的另一種GPR45信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游反應(yīng)物-細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)解激酶磷酸化的時間過程。在10分鐘時所有細(xì)胞的細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)激酶磷酸化達(dá)到最高水平，此后水平下降。以Arg386Pro GPR54轉(zhuǎn)染細(xì)胞的磷酸化的細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)激酶下降速度慢于野生型GPR45轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在暴露于吻肽60分鐘后Arg386Pro GPR54轉(zhuǎn)染細(xì)胞的水平仍然顯著較高（圖3）。GPR54結(jié)合的動力學(xué)研究同樣說明了吻肽刺激后Arg386Pro GPR54在細(xì)胞漿膜中的存留時間長于野生型。

討論

    在人類，青春期開始需要下丘腦脈沖式釋放GnRH。吻肽-GPR54信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體似乎是刺激神經(jīng)系統(tǒng)而激活GnRH分泌。因為間歇性灌注這種蛋白引起大鼠過早的性成熟和猴GnRH過早釋放，所以哺乳動物模型確實提示了吻肽的重要作用。

    在本研究中，我們在一名特發(fā)性性早熟女孩鑒別出了GPR45的雜合突變，Arg386Pro。這名女孩在出生時就開時乳房發(fā)育，但進(jìn)展緩慢，提示雌性激素過早的持續(xù)輕微增長。根據(jù)第二性征逐漸發(fā)育、生長和骨成熟度的加速，排除了單純性乳房初發(fā)育。雖然在開始評價病人時GnRH刺激后的LH水平在青春期開始的邊緣，但約8%的促性腺激素依賴性性早熟女孩在GnRH刺激后有青春期前的LH水平。本研究中使用GnRH激動劑對性腺軸的作用證實了存在中樞性GnRH軸的激活。在這類收養(yǎng)女孩，分離分析不可行，因為沒有其生物學(xué)家庭的遺傳研究。盡管如此，在種族匹配人群以及美國人和歐洲人群無Arg386Pro突變，提示Arg386Pro的突變不是GPR54多態(tài)性。

    體外研究顯示，在基礎(chǔ)條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Arg386Pro GPR54與野生型GPR54激活無顯著性差異，說明Arg386Pro突變未產(chǎn)生受體構(gòu)成性激活。轉(zhuǎn)染GPR54突變、野生型GPR54并以吻肽孵育的細(xì)胞、在與吻肽結(jié)合的離解常數(shù)和劑量-反應(yīng)曲線上基線與最大反應(yīng)之間的半數(shù)反應(yīng)、或是對吻肽的最大結(jié)合能力或反應(yīng)也均無差異顯著性，說明了GPR54突變與其配體的親和力以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面上的表達(dá)水平未改變。

    然而，在重復(fù)時間過程研究中，轉(zhuǎn)染野生型Arg386Pro GPR54的細(xì)胞在吻肽刺激后的肌醇磷酸積累下降的速度慢于野生型轉(zhuǎn)染細(xì)胞，因此在長至18小時過程中肌醇磷酸顯著較高。同樣，細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化持續(xù)時間很長，證實了在對吻肽的反應(yīng)中通過GPR54突變的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的時間延長。這些結(jié)果說明了GPR54突變的減敏速度顯著下降。配體結(jié)合的動力學(xué)研究顯示，在吻肽刺激后Arg386Pro GPR54在細(xì)胞表面漿膜上的存留時間長于野生型，提示了突變受體內(nèi)化或降解速度下降。

    G蛋白耦聯(lián)受體減敏可通過受體的磷酸化兒發(fā)生，通常在羧基末端由細(xì)胞內(nèi)的激酶引起，導(dǎo)致受體與G蛋白和其它細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路解耦聯(lián)。這樣的磷酸化可能增強抑制蛋白的結(jié)合，啟動受體的內(nèi)化。在非依賴促腎上腺皮質(zhì)激素的庫欣氏綜合癥病人，報告了類似的減敏損害的受體激活的機制，引起這種激活的是黑皮質(zhì)素2受體羧基末端突變，黑皮質(zhì)素2受體是G蛋白耦聯(lián)受體的一種，影響G蛋白α亞單位G_s 而不是G_q的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

    僅在少數(shù)遺傳疾病鑒別出了G蛋白耦聯(lián)受體功能增強性突變，大部分突變引起受體構(gòu)成性激活和下游的細(xì)胞反應(yīng)。但是，可能預(yù)期GPR54構(gòu)成激活阻斷脈沖式GnRH釋放，由此而導(dǎo)致青春期延遲而不是性早熟。對性腺幼稚的猴連續(xù)灌注吻肽確實降低了LH水平。與此相反，我們報告了非構(gòu)成性受體激活模型，其特征為GPR54減敏速度下降。這種機制可能導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)長時間增強，因此對于吻肽的刺激出現(xiàn)GnRH脈沖振幅增加的釋放反應(yīng)。

    青春期下丘腦吻肽表達(dá)增長貢獻(xiàn)于生殖軸的成熟。我們推測在Arg386Pro突變所見的 GPR54減敏下降可能增加了吻肽對GnRH分泌的刺激作用，因此加速生殖軸的成熟。而且本文病人新生兒期的乳房發(fā)育可能與吻肽-GPR54系統(tǒng)的新生兒激活一致，類似于特發(fā)性促性腺激素不足性腺機能減退男性嬰兒由于GPR54功能損失突變而出現(xiàn)的隱睪和小陰莖疾病。

    結(jié)論，我們鑒別出了常染色體顯性Arg386Pro GPR54突變，這種突變延長了細(xì)胞內(nèi)GPR54信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對吻肽的反應(yīng)，似乎與中樞性性早熟表型相關(guān)。

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