自然出現(xiàn)的人促性腺激素釋放激素（GnRH）受體突變對促性腺激素基因表達和GnRH調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導的影響
前言
人GnRH受體(hGnRHR)是促性腺細胞表面存在的7個跨膜G蛋白相耦聯(lián)的受體。在與hGnRHR結(jié)合時，下丘腦的十肽GnRH刺激垂體前葉的基因表達，合成和釋放促性腺激素-LH和FSH。，配體對hGnRHR的刺激通過磷脂酶C（PLC）的增加，引起信號發(fā)放，導致細胞內(nèi)外鈣源的動員，激活PKC和MAPK通路。蛋白激酶A（PKA）/cAMP通路可能也被GnRH激活。雖然通常使用GnRH經(jīng)PLC激活引起肌醇磷酸生成來評價對GnRH的信號轉(zhuǎn)導反應，但不清楚這個通道的激活與促性腺激素亞單位的刺激和GnRHR基因的表達是否有關?？刂苹蜣D(zhuǎn)錄的GnRH刺激確切機制也尚未確定。
因為GnRH在調(diào)節(jié)生殖功能中的重要作用，所以在特發(fā)性促性腺激素不足性腺機能減退病人篩查hGnRHR的突變。結(jié)果，鑒別出了許多與生殖功能異常相關的自然出現(xiàn)的hGnRHR基因突變。在體外，這些hGnRHR突變的功能分析表明，改變了細胞表達水平、配體結(jié)合，和/或信號轉(zhuǎn)導。在部分IHH病人最早鑒別出了兩種普遍自然出現(xiàn)的hGnRHR突變，它們分別為，第一次細胞外環(huán)中在106位置上(Gln106Arg)谷氨酰胺被精氨酸取代和第三次細胞內(nèi)環(huán)中在262位置(Arg262Gln)上精氨酸被谷氨酰胺取代。這兩種hGnRHRs突變的功能分析顯示，Gln106Arg突變顯著減少了GnRH的結(jié)合，而Arg262Gln對體內(nèi)受體親和力影響很小。有趣的是，兩種突變引起類似的PLC激活，表現(xiàn)為對GnRH的細胞內(nèi)IP生成減少反應。后來，在幾名不同表型的IHH病人發(fā)現(xiàn)，Gln106Arg和Arg262Gln突變以混合雜合性同時出現(xiàn)或結(jié)合其它hGnRHR突變存在。最近，在一名男性無睪綜合癥病人和一名女性部分IHH病人發(fā)現(xiàn)了純合Gln106Arg突變。
要更好地了解存在Gln106Arg和/或Arg262Gln突變病人的表型和基因型之間的關系，重要的是確定突變受體與GnRH結(jié)合下游的功能和IP產(chǎn)物。特別是突變受體對GnRH所產(chǎn)生的促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達反應的影響有重要的病理學意義。此外，部分失活的hGnRHR突變-Gln106Arg和Arg262Gln，是研究GnRH調(diào)節(jié)促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達中的信號轉(zhuǎn)導通路的有用工具。
本研究在體外分析了Gln106Arg 和 Arg262Gln對GnRH刺激的促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子激活的影響。盡管這兩種突變受體引起類似的對GnRH的IP反應減小，但對GnRH刺激的促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達有不同的影響。因此，也研究了突變受體對其它信號轉(zhuǎn)導通路的影響，以確定兩種突變導致不同效應的機制。
材料與方法
細胞培養(yǎng)
所有培養(yǎng)試劑由Life Technologies Inc獲得。在低葡萄糖DMEM中培養(yǎng)COS-7和GH3細胞。在37℃下5% CO2的潮濕空氣中，孵化細胞。
定點誘變
使用定點誘變，將Gln106Arg 或 Arg262Gln引入Dr. Thomas Gudermann所提供的編碼野生型hGnRHR表達載體。在Gln106Arg hGnRHR突變中，使用引物對：sense, 5'-GTGGACATTACAGTCCGATGGTATGCTGGAGAG-3',和 antisense, 5'-CTCTCCAGCATACCATCGGACTGTAATGTTCCA C-3'，在hGnRHR核苷酸372位置上，Gln 密碼子 CAA 被Arg 密碼子 CGA所替代。在Arg262Gln hGnRHR突變中，使用引物對: sense, 5'-CAATATACCAAGAGCACAGCTGAAGACTCTAAAAATGACG-3',和antisense, 5'-CGTCATTTTTAGAGTCTTCAGCTGTGCTCTTGGTATATTG-3'，在hGnRHR 840位置上Arg密碼子 CGG 被 Gln 密碼子 CAG替代。使用QuikChange 定點誘變藥盒產(chǎn)生hGnRHR突變，所插入的突變由雙向測序證實。
免疫細胞化學
COS-7細胞涂于35mm的玻璃培養(yǎng)皿中，使用GenePorter轉(zhuǎn)染試劑(野生型, Gln106Arg,或Arg262Gln)，或?qū)φ毡磉_載體(pcDNA3)，進行瞬時脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。在37℃下孵育48小時后，以冰凍PBS洗滌細胞，在室溫下以新鮮的4%甲醛溶液固定30分鐘，以PBS洗滌兩次，在室溫下以PBS/1%BSA閉鎖30分鐘。在37℃下以5ug/ml抗（HA）熒光劑抗體整夜孵化細胞，并以PBS洗滌4次。使用共焦激光顯微鏡在x40油浸接物鏡下檢測細胞完整表面上的野生型和突變型hGnRHRs。
受體結(jié)合測定
COS-7細胞涂于60mm組織培養(yǎng)皿中，每hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3井3ug經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法瞬時轉(zhuǎn)染。在37℃下孵育48小時后，以DMEM和0.1% BSA洗滌細胞，在室溫下，使用Dr. P. Michael Conn所提供的100000cpm 125I-布舍瑞林孵育90分鐘，增加非標記GnRH濃度 (10-12至10-6 M) 。以冰凍PBS洗滌兩次，以0.2 M NaOH, 0.1% SDS溶解。計算溶解的細胞蛋白含量，使用γ計數(shù)器測量放射性。根據(jù)同源競爭結(jié)合分析方法的非線性回歸計算離解常數(shù)(Kd)和最大結(jié)合率(Bmax)。每一實驗至少重復三次。
IP測定
以前已經(jīng)報告了測量總IP產(chǎn)物所應用的方案。在6井培養(yǎng)板上，通過每hGnRHR 結(jié)構(gòu)或pcDNA3井2ug電穿孔瞬時轉(zhuǎn)染 COS-7細胞。在37℃下24小時孵育后，以1ml去纖維醇的DMEM置換培養(yǎng)基2小時，然后以含有2 µCi myo-(2-3H)纖維醇相同的1ml培養(yǎng)基替換，15分鐘后加10 mM LiCl。在37℃下孵育16小時后，以逐漸增加濃度(10-11至10-6 M)的GnRH刺激細胞45分鐘，進行時間過程研究，GnRH誘導的IP積聚在45分鐘時最大。在冰中以20 mM的甲酸萃取細胞兩次，以7.5 mM HEPES and 150 mM KOH將溶解物中和到pH7.5。以14,000 x g離心2分鐘后，測量溶解物中的蛋白，取上清液至Ag-X8陰離子樹脂交換柱。以5ml ddH20,然后以5ml的5mM濃度的硼砂, 60 mM甲酸鈉洗滌。以3 ml的0.9 M 甲酸銨, 0.1M 甲酸萃取IPs。使用閃爍記數(shù)器測量洗脫液中的放射活性結(jié)合，每一樣本以蛋白量修正，所有測量進行三次。每一實驗至少重復三次。
熒光素酶的測定
通過大鼠LHß基因-797/+5、FSHß基因-2000/+698，人
GSU基因-846/0，和小鼠GnRHR基因-1164/+62與熒光素酶（Puc）cDNA融合產(chǎn)生指示結(jié)構(gòu)。cAMP反應成分（CRE）指示結(jié)構(gòu)含有4個熒光素酶上游CREs。以每井2ug的hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3，每井2ug的GSU-Luc、FSHß-Luc、LHß-Luc或GnRHR-Luc、或1ug 的CRE-Luc，每井1ug魯斯肉瘤病毒β-半乳糖苷酶載體，電穿孔瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞。然后將細胞種入6井組織培養(yǎng)板中，在37℃下孵化48小時，以逐漸增加濃度(10-11 至10-5 M)的GnRH刺激4小時（根據(jù)時間過程研究，在這個時間點上得到最大的GnRH刺激的Luc活性）。以冰凍PBS洗滌細胞兩次。以125 mM 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和0.5% 氚核溶解細胞。在4℃下14,000 x g離心后，測量上清液Luc和ß-半乳糖苷酶活性，結(jié)果以非刺激樣本的倍數(shù)表示。所有點進行三次測定，每一試驗至少重復3次。
ERK-1磷酸化的蛋白質(zhì)印跡分析
以每井2ug的hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3，以及每井2ug的HA示蹤野生型ERK-1表達載體瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞。在37℃下孵育24小時后，在0.1% BSA穩(wěn)定的無血清培養(yǎng)基（DMEM）中孵化細胞24小時，然后以逐漸增加濃度(10-10至10-5 M)的GnRH刺激10分鐘。時間過程研究表明，GnRH引起的ERK-1磷酸化在10分鐘時達到最大。然后在冰上以含有0.1% mg/ml的苯甲基磺酰氟、30 mg/ml抑肽酶和1 mM的釩酸鈉的 RIPA 緩沖劑(1 x PBS, 1% 非離子型表面活性劑 CA-630, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS)溶解細胞，并超聲粉碎20秒。在4℃下14,000 x g離心后，測量上清液中的蛋白含量，每井40ug變性蛋白加入到12%的聚丙烯酰胺凝膠中，按照標準程序進行電泳分析。將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在4℃下以Blotto整夜阻斷。在37℃下的Blotto中以抗p-ERK抗體孵化膜2小時，以TBS,0.05% Tween-20洗滌3x10分鐘，以TBS洗滌1x10分鐘。然后在37℃下再以與辣根過氧化物酶（HRP）共軛的單克隆第二抗體在Blotto中孵化1小時，在進行適當?shù)南礈?。在化學發(fā)光法檢測后，將膜在膠片上曝光。在帶洗滌后，在Blotto中以抗-(HA)-HRP抗體再次復制1小時，修正轉(zhuǎn)染率和蛋白裝載。修正的結(jié)果以掃描非刺激樣本膠片的密度分析的倍數(shù)表示。每一實驗至少重復三次。
計算和統(tǒng)計分析
每組實驗數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析，計算每研究的ED50。所有統(tǒng)計分析使用Instat3.0，并根據(jù)非參數(shù)的非配對t檢驗（P <0.05）
結(jié)果
突變的hGnRHRs細胞表面的表達
為保證突變hGnRHRs的表達，以hGnRHR結(jié)構(gòu)瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞，并以免疫細胞化學方法分析固定的完整細胞表面野生型和突變受體的表達。使用野生型hGnRHR表達載體作為陽性對照，使用pcDNA3作為陰性對照。所有hGnRHR 表達載體氨基端都有HA表位標簽，以有利于無有效抗GnRHR抗體的受體測定。在以熒光素共軛的抗-HA-抗體孵化轉(zhuǎn)染細胞后,獲得了共焦熒光顯微鏡圖像（圖1）。在以野生型hGnRHR 以及Gln106Arg、Arg262Gln突變轉(zhuǎn)染細胞的外圍檢測到了熒光，但在以pcDNA3轉(zhuǎn)染的細胞表面未發(fā)現(xiàn)熒光。所有hGnRHRs的螢光形式類似，提示了正常的細胞表達和向膜的轉(zhuǎn)運。雖然不能完全排除氨基端HA標簽的存在可能影響細胞表面的表達或與配體的結(jié)合，但未觀察到對野生型hGnRHRs的影響。
受體結(jié)合的特征
為測量GnRH結(jié)合，以每種hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3轉(zhuǎn)染COS-7細胞。為進行置換層析分析，以100,000 cpm 125I-布舍瑞林和增加濃度的非標記的GnRH孵化細胞。在同源競爭結(jié)合分析的非線性回歸后，計算野生型、Gln106Arg和Arg262Gln hGnRHR結(jié)構(gòu)的Kd和Bmax（表1）。pcDNA3與GnRH無結(jié)合，而在野生型與Arg262Gln GnRHR之間，親和力或受體數(shù)量無顯著性差異。因為Gln106Arg的結(jié)合顯著減少，所以不能準確地計算Kd和Bmax。這些結(jié)果與以前報告的突變一致。
對GnRH的反應-IP的積聚
為證實本研究使用的hGnRHR結(jié)構(gòu)保持了部分細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路激活功能，測量了瞬時轉(zhuǎn)染的COS-7細胞對GnRH劑量漸增的IP生成反應。野生型hGnRHR能夠介導10倍的IP積聚刺激，ED50為2.5 nM GnRH（圖2，表1）。兩種突變引起劑量-反應曲線向右偏移，類似導致ED50增長約7倍，也與以前的報告一致。作為陰性對照，pcDNA3并不刺激IP生成。使用瞬時轉(zhuǎn)染的GH3細胞，這些突變也同樣導致類似的調(diào)節(jié)GnRH刺激IP的結(jié)果。
不同GnRHRs突變對GnRH促性腺激素亞單位基因啟動子活性的影響
GnRH刺激促性腺激素生物合成的信號轉(zhuǎn)導通路尚未完全闡明。尚不了解IP生成是否與促性腺激素亞單位基因表達高度相關。因此，測量表達突變hGnRHRs 的細胞中GnRH刺激促性腺激素亞單位基因表達的能力。
以hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞，Luc標記與LHß、 FSHß、
GSU啟動子以及RSV-ß-半乳糖苷酶融合。當使用COS-7細胞做這些實驗時，甚至在野生型，都未觀察到促性腺激素亞單位或GnRHR基因啟動子活性受到GnRH的刺激。與此相反，前面說明的GH3細胞支持了促性腺激素激素亞單位和GnRHR基因啟動子對GnRH的反應性。如上所述，在GH3和COS-7細胞，hGnRHRs突變對GnRH調(diào)節(jié)的IP生成有類似的影響，因此而驗證了兩種模型的比較。
圖3為以LHß-Luc、FSHß-Luc、GSU-Luc轉(zhuǎn)染的GH3細胞的劑量-反應分析。在表1中匯總了每種促性腺激素亞單位和受體結(jié)構(gòu)的ED50。對LHß-Luc，Gln106Arg 和Arg262Gln兩種突變引起ED50分別增加8.8和8.1倍（即對GnRH的敏感性下降，圖3A，表1）。因此，兩種突變受體降低GnRH刺激的LHß基因啟動子活性的程度相同，其方式也與對GnRH刺激的IP生成的影響相似。
兩種突變受體降低了FSHß亞單位基因啟動子對GnRH的敏感性，與野生型比較，Gln106Arg和 Arg262Gln分別降低了14和15倍（圖3Bhe biao 1）。雖然兩種突變降低對GnRH的敏感性程度相同，但這些影響大于對GnRH刺激的IP生成和LHß基因啟動子刺激的影響。有趣的是，在這些研究中，相對于野生型受體來說，F(xiàn)SHß亞單位基因啟動子對于GnRH的敏感性約比LHß或
GSU基因啟動子大5倍。
就GSU基因啟動子來說，Gln106Arg對GnRH敏感性下降相對于野生型受體下降3.8倍，Arg262Gln下降了10.6倍（圖 3C，表1）。有趣的是，Arg262Gln突變對于GnRH介導GSU-Luc刺激的劑量-反應曲線的影響大于Gln106Arg突變。兩種突變對GSU的影響，不同于對GnRH刺激IP生成和LHß、FSHß基因啟動子活性的影響。
GnRH對GnRHR基因啟動子活性的刺激
因為GnRH調(diào)節(jié)本身受體的表達，所以由于hGnRHR突變而出現(xiàn)的hGnRHR基因啟動子刺激的差異可能導致在體細胞表面受體數(shù)量的變化。因此，進行實驗來研究兩種hGnRHR突變是否影響對GnRH刺激的GnRHR基因表達。以hGnRHR結(jié)構(gòu)或 pcDNA3瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞，熒光素酶示蹤劑融合到小鼠GnRHR基因啟動子(GnRHR-Luc)和RSV-ß-半乳糖苷酶載體。圖3D為得到的劑量-反應曲線，ED50列于表1。GnRHR基因啟動子對GnRH的敏感性中等程度下降，Gln106Arg下降2.2倍（即ED50增加），Arg262Gln下降3.7倍。如對GSU的不同影響一樣，兩種突變的hGnRHRs對于GnRH刺激GnRHR基因啟動子活性的劑量-反應曲線有不同的影響。
GnRH刺激的ERK激活
Gln106Arg和Arg262Gln對促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子激活的影響提示，這兩種不同的受體突變可能對GnRH激活基因表達的信號轉(zhuǎn)導通路有不同的影響。兩種突變受體對GnRH刺激IP生成的影響相同僅部分解釋了這些明顯不同的影響，提示了可能存在另外的信號轉(zhuǎn)導通路。已經(jīng)證明GnRH刺激FRK活性，這個MAPK通路在GSU基因啟動子轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮作用，并增加LHß蛋白。因此，我們測定了Gln106Arg和Arg262Gln對GnRH刺激ERK通路的影響。
因為在我們的瞬時轉(zhuǎn)染范例中，內(nèi)源性磷酸化ERK水平掩蓋了GnRH介導ERK激活的影響，所以，用每種hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3，以及HA示蹤的野生型ERK-1表達載體瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞。并以漸增GnRH濃度刺激細胞，然后進行蛋白質(zhì)印印跡分析。在圖4A中表示了野生型和突變受體GnRH對ERK-1的劑量依賴性激活，以及pcDNA3陰性對照的無GnRH刺激的ERK活性。使用譜帶強度的密度分析，確定相對于總HA-ERK-1的磷酸化HA-ERK-1，并用來修正轉(zhuǎn)染率和蛋白裝載。使用這些數(shù)據(jù)生成劑量-反應曲線（圖4B），計算每種受體結(jié)構(gòu)ERK-1激活的ED50（表1）。對于Gln106Arg，ED50是野生型的2.7倍，而Arg262Gln的ED50增加到5.1倍。因此，Gln106Arg和Arg262Gln對GnRH刺激ERK活性的ED50有不同的影響，與這些突變對GSU和GnRHR基因啟動子活性的影響方式相似。
GnRH刺激的CRE-Luc激活
已經(jīng)提出，GnRH刺激的cAMP依賴性通路可能具有調(diào)節(jié)促性腺激素亞單位基因表達和LHß水平的作用。通常使用刺激的CRE-Luc作為cAMP誘導的標志。為了測量CRE介導的轉(zhuǎn)錄，以hGnRHR結(jié)構(gòu)或pcDNA3、 CRE-Luc示蹤結(jié)構(gòu)和RSV-ß-半乳糖苷酶載體瞬時轉(zhuǎn)染GH3細胞，以漸增濃度的GnRH刺激細胞，產(chǎn)生劑量-反應曲線（圖5）。Gln106Arg突變的GnRH刺激活性的ED50比野生型高2.7倍，而Arg262Gln突變則高6.7倍（表1）。因此，Gln106Arg和Arg262Gln突變對GnRH刺激依賴CRE的轉(zhuǎn)錄有不同的影響，與GnRH介導
GSU、GnRHR基因啟動子刺激和ERK激活所觀察到的方式一致。
討論
在本研究中，我們分析了hGnRHR的Gln106Arg and Arg262Gln突變對GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達的影響。此外，也研究了對信號轉(zhuǎn)導通路的影響，以確定兩種突變可能改變GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子活性的機制。
由于較高的轉(zhuǎn)染率，我們在COS-7細胞完成了結(jié)合測定和IP的分析。這種細胞系也常用于計算全細胞或膜片段的Kd和測量IP水平，描述hGnRHRs突變的特征。由于COS-7細胞對GnRH無反應，所以后來使用GH3細胞進行實驗，測量促性腺激素亞單位基因啟動子活性。因此，我們使用GH3細胞重復了IP分析，雖然在GnRH刺激后IP積聚增長的幅度不如COS-7細胞，但兩細胞系野生型和突變受體之間的ED50差異是相同的，驗證了這些比較。
有趣的是，盡管GnRH介導IP生成的敏感性類似下降，但Gln106Arg和 Arg262Gln hGnRHR突變卻導致了促性腺激素亞單位基因?qū)nRH的顯著不同的敏感性。在檢測突變受體之前，我們首先觀察到，對于野生型hGnRHR，F(xiàn)SHß亞單位基因啟動子對GnRH刺激的敏感性高于LHß或
GSU基因啟動子。這個結(jié)果與以前關于引起FSH分泌需要的GnRH量少于LH的在體觀察相一致。此外，曾有報告，在腎包膜下移植腺垂體并給以GnRH處理的垂體切除大鼠，在LH之前FSH血漿濃度增加。野生型FSHß基因啟動子對GnRH的敏感性較高提示，F(xiàn)SHß基因?qū)τ诩毎麅?nèi)通路激活的敏感性大于LHß和GSU基因，或是存在不同的信號通路。
突變受體劑量-反應曲線的分析顯示，Gln106Arg和Arg262Gln使FSHß亞單位基因啟動子對GnRH的敏感性減少的程度大于LHß或GSU。這可能是由于促性腺激素亞單位基因?qū)餐男盘栟D(zhuǎn)導通路的劑量依賴性激活的下降有不同的敏感性。但是，F(xiàn)SHß基因?qū)Φ蛣┝康腉nRH有較高的敏感性，所以可以預期該基因轉(zhuǎn)錄的激活受到共同信號轉(zhuǎn)導通路的損害的影響較小，而非更受影響。這將支持促性腺激素亞單位基因?qū)nRH的不同反應可能存在一條以上的信號轉(zhuǎn)導通路。
Gln106Arg和Arg262Gln對GnRH刺激的GSU基因啟動子活性有顯著不同的影響。兩種突變都降低了GSU基因?qū)nRH的敏感性，但是Arg262Gln hGnRHR突變的ED50的變化更明顯。盡管二者對GnRH調(diào)節(jié)的IP生成影響相同，但對GSU基因活性的影響不同。與此相反，兩種突變對LHß和FSHß亞單位基因?qū)nRH敏感性的影響相似。所以，GSU基因似乎與不同于LHß或FSHß基因激活的信號轉(zhuǎn)導通路有關，而可能取決于不同的機制。顯然，僅測量IP產(chǎn)物不適用于確定生理活動中的突變受體功能。在本文突變受體引發(fā)的不同下游影響中，非?？赡艽嬖诮?jīng)PLC以外的重要信號轉(zhuǎn)導通路，應更詳細地加以研究。
與對GSU基因活性的影響類似，Gln106Arg和Arg262Gln hGnRHR突變也引起GnRHR基因啟動子對GnRH敏感性的不同下降，其中僅Arg262Gln突變達到統(tǒng)計學顯著性。垂體促性腺激素細胞對GnRH的反應與細胞表面的GnRHRs濃度直接相關，GnRHRs濃度部分受到GnRHR基因表達水平的影響。因為GnRH本身調(diào)節(jié)自己受體的表達，所以可以預期，GnRH刺激GnRHR基因啟動子激活的障礙，將不能引起GnRH脈沖引起的受體上調(diào)，貢獻于促性腺激素細胞表面GnRHRs數(shù)量的下降。反過來，進一步增加GnRH在體的抵抗。
在本研究中，我們未分析突變對細胞表面表達的可能影響。除了對劑量-反應曲線和ED50值的影響外，Gln106Arg 和 Arg262Gln突變可能也影響這些受體的合成/降解速率，導致GnRHR水平的變化。這些考慮與最近報告的看法非常一致，這些研究報告某些突變GnRH受體表達水平降低，這些突變的結(jié)構(gòu)改性或是使用能透過膜的非肽類hGnRH拮抗劑可部分恢復配體的結(jié)合，刺激IP的生成。在我們的配體結(jié)合測定中，Bmax指標證實轉(zhuǎn)染細胞表達了相同量的野生型和Arg262Glu hGnRHRs。雖然因所檢測的結(jié)合受體水平很低，我們未能夠定量Glu106Arg的Bmax，但共焦顯微鏡分析指出，野生型和Glu106Arg受體細胞表面的螢光表現(xiàn)相似。盡管如此，我們目前的研究集中在Gln106Arg 和 Arg262Gln對GnRH激活單一信號轉(zhuǎn)導通路和基因轉(zhuǎn)錄的ED50值的影響。雖然受體數(shù)量的變化可能影響特定GnRH濃度下的絕對反應和最大反應，但可以預期ED50值保持不變。已經(jīng)證明，ED50與受體數(shù)量無關，而是反應了受體對配體親和力以及受體與效應物耦合（例如，G蛋白）的變化。特別是，曾經(jīng)證明GnRH激動劑刺激GH3細胞IP生成的潛力與GnRHR濃度無關。我們進行的野生型、Glu106Arg、Arg262Glu GnRHRs的GnRHR分析也說明，突變受體對GSU基因啟動子對GnRH的敏感性的不同影響與受體濃度無關（未報告數(shù)據(jù)）。然而，ln106Arg 和 Arg262Gln突變對受體數(shù)量或循環(huán)的影響是進一步研究的方向。
雖然野生型hGnRHR存在HA標記對細胞表面的表達或功能無影響，但我們并不能完全排除HA標記對突變受體功能的影響。在這方面，值得注意的是，我們研究中Gln106Arg和Arg262Gln對配體結(jié)合和IP產(chǎn)物的影響與以前的研究（使用無HA標記的受體）相一致。而且，如上所述，HA標記對突變受體細胞表面表達的可能影響并不影響ED50值。
為了確定Gln106Arg和Arg262Gln突變是否影響經(jīng)IP產(chǎn)物之外的其它信號轉(zhuǎn)導通路-GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達，我們研究了GnRH對ERK磷酸化和依賴CRE轉(zhuǎn)錄的刺激。已經(jīng)提出，ERK/MAPK通路在GnHR介導的GSU、可能的LHß基因、FSHß基因的轉(zhuǎn)錄激活和LHß蛋白的表達中發(fā)揮作用。在原代垂體細胞培養(yǎng)和T3–1、LßT2促性腺激素細胞系中，GnRH激活ERK級聯(lián)。基礎的和GnRH刺激的GSU基因活性似乎通過ERK通路來調(diào)節(jié)。ERK或其它MAPKs也似乎在GnRH調(diào)節(jié)LHß基因表達中發(fā)揮作用。我們的結(jié)果證實，Gln106Arg和Arg262Gln突變hGnRHRs對GnRH激活ERK通路有不同影響。兩種突變hGnRHRs降低了GnRH引起的ERK激活的敏感性，但Arg262Gln hGnRHR突變引起的ED50變化更大于Gln106Arg，與GSU和GnRHR基因啟動子對GnRH的激活反應中所觀察到ED50變化方式相同。有趣的是，雖然GnRH調(diào)節(jié)的ERK激活出現(xiàn)在蛋白激酶C的下游，盡管本文所研究的兩種突變對GnRH調(diào)節(jié)的IP生成有相同的影響，但對GnRH引起ERK激活的影響不同。其它的信號轉(zhuǎn)導通路，鈣離子流和上皮生長因子受體]酪氨酸激酶，也可能作用于GnRH調(diào)節(jié)的ERK激活，并貢獻于Gln106Arg和Arg262Gln對ERK通路的不同影響。
幾項報告提出，GnRH刺激的依賴cAMP通路可能也作用于GnRH調(diào)節(jié)的促性腺激素亞單位基因。已經(jīng)證明cAMP增加原代大鼠垂體細胞培養(yǎng)中的LHß和GSU mRNA水平，細胞內(nèi)cAMP水平下降引起GnRH刺激的促性腺激素亞單位mRNA水平和促性腺激素分泌減少，提示PKA通路可能貢獻于GnRH刺激的促性腺激素亞單位基因的表達。另外，已經(jīng)證明GnRHR與LßT2 細胞內(nèi)Gs及Gq結(jié)合，GnRH刺激導致cAMP水平的增加。Gs通路的特異阻斷引起ERK活性下降和c-fos及 LHß蛋白的減少。我們在分析hGnRHR突變中，使用了GnRH刺激CRE-Luc作為誘導cAMP通路的標志。對于依賴CRE的轉(zhuǎn)錄，在GnRH刺激GSU和GnRHR基因啟動子活性時觀察到，Gln106Arg和Arg262Gln突變的影響表現(xiàn)出了類似的GnRH敏感性損失，Arg262Gln hGnRHR突變引起引起ED50的變化仍然大于Gln106Arg。因此，我們的數(shù)據(jù)提示，cAMP調(diào)節(jié)通路也是介導Gln106Arg和Arg262Gln不同影響的候選者。但是，應當注意到CRE對除cAMP/PKA以外的通路是敏感的。其中應特別注意磷酸化和CRE結(jié)合蛋白B的激活出現(xiàn)在MARK激活的下游。可能存在幾種信號轉(zhuǎn)導通路通過復雜的聯(lián)系系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)促性腺激素亞單位和GnRHR基因的表達。
在體外研究中使用兩種自然出現(xiàn)的常見突變，可能有助于闡明hGnRHR結(jié)構(gòu)變化是如何作用于部分失活突變病人的相當不同表型。以前已經(jīng)在不同程度IHH病人鑒別出了Gln106Arg和Arg262Gln hGnRHR突變。最近，發(fā)現(xiàn)一名不育綜合癥男性病人為純合性Gln106Arg hGnRHR突變。此外，一名純合性Gln106Arg hGnRHR突變女性病人實現(xiàn)了自然懷孕。在所報告的男性病人中，兩種促性腺激素基礎水平均在正常范圍內(nèi)，對于一次注射GnHR（100ug）的反應，促性腺激素的增長不同，LH的增長大于FSH。同樣，7天脈沖式GnRH處理僅引起LH反應，F(xiàn)SH未增長。這些在體的反應與我們體外觀察到的Gln106Arg突變引起FSHß基因?qū)nRH的敏感性降低程度大于LHß和GSU的結(jié)果一致。如Pitteloud et al.提出的，F(xiàn)SH對GnRH無反應，也可能是由于這些男性病人有相對較高的循環(huán)抑制素B水平。
至今，尚未在病人觀察到純合性Arg262Gln突變。但報告了幾種存在Gln106Arg 和Arg262Gln突變的混合雜合性。雖然看到了這些混合雜合性表型的可變性，但非?？赡苁怯捎谛詣e和其它內(nèi)分泌對生殖控制的影響，這些病人都表現(xiàn)出比相對輕微臨床表現(xiàn)的Gln106Arg純合性有嚴重的多的IHH表型。僅根據(jù)IP反應的評價可能會對表型嚴重性差異感到奇怪，但由兩種突變的hGnRHRs對GSU的刺激表現(xiàn)出不同的GnRH敏感性下降可以得到解釋。而且，Arg262Gln 引起的GnRH對GnRHR基因表達刺激的下降程度也大于Gln106Arg。這就可以預期，與Gln106Arg純合性相比，混合雜合性的促性腺激素細胞表面GnRHR受體數(shù)量減少，將進一步形成對GnRH刺激促性腺激素細胞的復合抵抗。
總之，我們在體外分析了兩種常見的hGnRHR自然突變-Gln106Arg和Arg262Gln，對GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因啟動子活性的影響。盡管兩種突變受體引起對GnRH的IP下降反應類似，但觀察到了對GnRH刺激促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達的不同影響，提示兩種突變對共同的信號通路有不同的作用，或者說，更可能對不同的信號轉(zhuǎn)導通路有顯著不同的影響。進一步的研究闡明了突變受體對GnRH刺激ERK活性和CRE介導的轉(zhuǎn)錄的確有不同的影響。僅測量廣泛用來估價hGnRHR突變信號發(fā)放能力的IP產(chǎn)物，顯然不適合確定相關生理活動中的突變受體的功能。對GnRH刺激的LHß、FSHß、GSU亞單位基因表達的不同影響可能解釋了某些hGnRHR突變引起IHH病人某些表型的變異。這些自然出現(xiàn)的突變是研究調(diào)節(jié)GnRH對促性腺激素亞單位和GnRHR基因表達不同影響的信號通道的有效工具。
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