摘要：在某些特發(fā)性矮身高和許多萊里-韋爾（Leri-Weill）軟骨骨生成障礙病人，SHOX（short stature homeobox-containing gene）突變引起單倍體不足（haploinsufficiency）。約80%的SHOX 突變?yōu)榛蛲耆笔?，其余的為各種點(diǎn)突變。本文目的為估價(jià)特發(fā)性矮身高兒童SHOX突變的發(fā)生率，提出單倍體不足的表型特征。我們募集了140名特發(fā)性矮身高兒童（61女）。特發(fā)性矮身高的定義為，有正常IGF-I和自由睪酮、女性有正常的核型，無(wú)肌內(nèi)膜抗體、長(zhǎng)期器質(zhì)性、心理性或綜合癥疾病，并且無(wú)明顯的骨發(fā)育異常征兆。測(cè)量記錄身高、臂展、坐高，計(jì)算坐骨下腿長(zhǎng)。以熒光引物PCR擴(kuò)增SHOX編碼區(qū)域附近兩個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(CA-SHOX 重復(fù)和DXYS233)，并以自動(dòng)測(cè)序儀分離。對(duì)每一標(biāo)記僅有1個(gè)片段大小的淵源者分析父母的DNA。在三個(gè)淵源者（2%）證實(shí)了由SHOX缺失引起的SHOX單倍體不足，三名病人都為女性，攜帶有父親等位基因的全部缺失。與其它137名檢測(cè)的兒童相比，臂、腿顯著縮短而有低-正常的坐高。因此，3名SHOX單倍體不足淵源者的肢體/軀干比例（腿長(zhǎng)與臂展之和除以坐高）顯著低于全組病人。這個(gè)觀察結(jié)果得到另外5名以前診斷為SHOX單倍體不足病人（4女）生長(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)的證實(shí)，除了一名年齡最小的女孩外，以身高調(diào)整的肢體/軀干比例低于平均數(shù)1SD以上。所有SHOX單倍體不足的兒童至少表現(xiàn)出一種萊里-韋爾軟骨骨生成障礙的X線表現(xiàn)特征——遠(yuǎn)側(cè)橈骨骺三角形化、遠(yuǎn)側(cè)排腕骨的錐體化、橈骨遠(yuǎn)側(cè)尺骨端透明。我們的觀察提示，可以肢體/軀干比例低于1.95+1/2身高（m）和手腕X線片的重要判斷篩選SHOX突變的兒童。

(J Clin Endocrinol Metab 88: 4891–4896, 2003)

在某些特發(fā)性矮身高（idiopathic short stature，ISS）和許多Leri-Weill軟骨骨生成障礙（Leri-Weill-dyschondrosteosis，LWD)病人，已經(jīng)報(bào)告了引起單倍體不足的擬常染色體SHOX（矮身高同源框基因）雜合性突變。Leri-Weill軟骨骨生成障礙是一種骨軟骨發(fā)育不良癥，有肢中性矮身高和腕部馬德隆畸形表現(xiàn)。由妊娠第二個(gè)月，SHOX開(kāi)始在人類(lèi)胚胎成骨細(xì)胞中表達(dá)。選擇性剪接生成兩種蛋白，其中非截短的SHOXa引起體外基因轉(zhuǎn)錄。在骨的個(gè)體發(fā)生、骨代謝和生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)中，它的確切作用尚不了解。約80%的SHOX突變?yōu)橥耆蛉笔В溆酁辄c(diǎn)突變。除了不成比例的矮身高外，LWD病人的常見(jiàn)征兆為肘外翻，高腭穹和脊柱側(cè)凸，與在染色體畸變基礎(chǔ)上有SHOX缺失的特納綜合征女性的部分表型相類(lèi)似。甚至在同一家庭，SHOX單倍體不足的表型高度可變，說(shuō)明了較差的基因型-表型關(guān)系。最初，在一名特發(fā)性矮身高兒童發(fā)現(xiàn)SHOX突變提出了兩個(gè)問(wèn)題：1）迄今有多少未知病因（特發(fā)性）的矮身高兒童有SHOX單倍體不足？2）在臨床上能夠識(shí)別表型嗎？最近，Rappold et al.報(bào)告了特發(fā)性矮身高兒童SHOX缺陷的發(fā)生率，但研究中未排除父母有馬德隆畸形的個(gè)體，也無(wú)生長(zhǎng)學(xué)和放射學(xué)確切數(shù)據(jù)。與此相反，其它兩個(gè)研究組未發(fā)現(xiàn)特發(fā)性矮身高兒童的SHOX缺陷，而是在矮身高和LWD的幾名淵源者發(fā)現(xiàn)有SHOX缺陷。

在本文中，我們報(bào)告了140名具有特發(fā)性矮身高特征的兒童所進(jìn)行的SHOX缺失篩查結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，我們提出特發(fā)性矮身高學(xué)齡兒童生長(zhǎng)學(xué)判斷方法，在骨骼生長(zhǎng)不成比例個(gè)體中確定SHOX分子學(xué)分析的候選者。而且也討論了特定X線表現(xiàn)的作用。

受試者和方法

個(gè)體

為了SHOX缺失篩查，由我們生長(zhǎng)研究中心3名有經(jīng)驗(yàn)的兒科內(nèi)分泌醫(yī)師募集了140名（61女）特發(fā)性矮身高兒童。年齡范圍在2.6~16.1歲（中位數(shù)9.1歲）。特發(fā)性矮身高定義為：IGF-I和自由T4正常，女性核型正常，無(wú)肌內(nèi)膜抗體，無(wú)長(zhǎng)期器質(zhì)性、心理性或畸形疾病，無(wú)明顯骨發(fā)育不良征兆（包括馬德隆畸形）。這些標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)于特發(fā)性矮身高定義共識(shí)。記錄身高、臂展和坐高，計(jì)算坐骨下腿長(zhǎng)。經(jīng)證實(shí)為SHOX的淵源者要在我們?cè)\所再次檢測(cè)，并再次拍攝左手腕X線片。也再次分析了10名肢體最短、無(wú)SHOX缺失的淵源者。此外，再次回顧性分析我們?cè)\所以前檢測(cè)出的SHOX單倍體不足兒童（n=5）的生長(zhǎng)學(xué)和放射學(xué)數(shù)據(jù)。

所有SD分值依據(jù)荷蘭標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。有所有兒童和/父母得到知情同意書(shū)。

方法

由血液淋巴細(xì)胞提取基因組DNA。使用熒光引物PCR擴(kuò)增位于Xp22.3前后和SHOX基因座的兩個(gè)高度多態(tài)性微衛(wèi)星，并以自動(dòng)測(cè)序儀器分離。以SHOX末端定位CA-SHOX重復(fù)，DXYS233周?chē)?00–350 kb位于SHOX近側(cè)。如果二者端粒標(biāo)記(DXYS233, CA-SHOX 重復(fù))之一僅有1個(gè)片段大小，則進(jìn)行父母DNA分析。這種分析能夠使我們區(qū)分純合子（相同大小的兩等位基因）與半合子（缺失一個(gè)等位基因）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在所有生長(zhǎng)學(xué)參數(shù)正態(tài)分布的基礎(chǔ)上，當(dāng)3名SHOX缺失兒童的數(shù)值在無(wú)SHOX缺失兒童組95%置信區(qū)間之外時(shí)，為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。使用JMO 4.0.5版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

通過(guò)位于SHOX基因座和2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的擴(kuò)增，在11名淵源者（7%）發(fā)現(xiàn)2標(biāo)記僅有單一片段，提示了半合子或純合子SHOX基因座。在11名淵源者中，僅8名有父母DNA，但有2名是不提供信息的。通過(guò)父母等位基因擴(kuò)增，在3名女孩（2%）證實(shí)了SHOX缺失的半合子（圖1）。通過(guò)以前報(bào)告的3個(gè)常染色體標(biāo)記的擴(kuò)增證明為父系。不提供信息的以及缺少父母DNA的5名淵源者未排除SHOX缺失。

3名受累淵源者的生長(zhǎng)學(xué)特征為短坐骨下腿長(zhǎng)、短臂展但有低-正常的坐高（相對(duì)于年齡）。為進(jìn)一步分析這一結(jié)果，我們將其與其它SHOX缺失陰性的137名淵源者的生長(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較（表1和圖2A-C）。3名受累淵源者的靶身高和體重（年齡的SDS）在未受累組的95%的置信區(qū)間之內(nèi)，但SHOX缺失女孩的骨骼比例與無(wú)SHOX缺失淵源者顯著不同。證實(shí)了骨不成比例是一個(gè)特殊的表現(xiàn)（表1）。當(dāng)依身高繪制臂展、腿長(zhǎng)和坐高圖時(shí)（圖2A-C），這種表現(xiàn)也同樣明顯。

為了將骨不成比例的相關(guān)數(shù)據(jù)整合為一項(xiàng)，我們確定了一項(xiàng)生長(zhǎng)學(xué)比值，將肢體與軀干長(zhǎng)度相比較（下面稱(chēng)為及肢體/軀干比）。肢體/軀干比的定義為，（坐骨下腿長(zhǎng)+臂展）/坐高。因此，有高肢體/軀干比為不成比例短肢體的矮身高兒童。圖3為所有淵源者依身高的肢體/軀干比。該圖示強(qiáng)調(diào)了在所有研究的特發(fā)性矮身高兒童中，3名SHOX缺失淵源者的骨不成比例（實(shí)心圓）的高度特殊性表現(xiàn)。肢體/軀干比例直線隨年齡和身高而增加，反應(yīng)了兒童期，臂和腿生理性生長(zhǎng)的速度高于軀干。

因此，我們的數(shù)據(jù)提示，在特發(fā)性矮身高兒童亞組篩查SHOX突變是最合理的，即篩查那些有低肢體/軀干比例表現(xiàn)的特發(fā)性矮身高兒童。如果篩查上限定義為肢體/軀干比例低于身高調(diào)整的平均數(shù)下1SDS，那么這樣的生長(zhǎng)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)可使約84%的矮身高兒童免于遺傳學(xué)篩查檢測(cè)。近似計(jì)算為小于1.95+1/2身高(m)，即圖3中的點(diǎn)線。為了檢驗(yàn)這樣一種篩查方法的敏感性，我們搜集了所有突變篩查中被排除的SHOX單倍體不足兒童的數(shù)據(jù)（n=5,4女），被排除的病人為有明顯馬德隆畸形（4號(hào)病人），Rao et al.報(bào)告的已知SHOX無(wú)義突變（5和6號(hào)病人），以及含有SHOX基因座的Xp末端著絲粒缺失（7和8號(hào)病人），表2。所有SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童的肢體/軀干比例都低于這一限度，說(shuō)明在這一組SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童，篩查方法有高度敏感性（100%），圖3。但是，骨不成比例的程度不同，該組中有一名年齡最小、身高最矮的兒童（5號(hào)病人）有較低而正常的肢體/軀干比例（身高2510px下2.51），但在一段時(shí)間后，下降到了低點(diǎn)（身高3132.5px下的2.45）。在她的受累的哥哥（6號(hào)病人），也觀察到隨時(shí)間的進(jìn)展骨不成比例程度加大（身高2927.5px時(shí)為2.50，在身高3615px時(shí)為2.48）。

因此，根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，在檢測(cè)SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童時(shí)，上述定義的肢體/軀干低于1.95+1/2身高(m)有100%的敏感性和85%的特異性。如果矮身高兒童SHOX單倍體不足發(fā)生率為2%，那么肢體/軀干比例小于1.95+1/2身高(m)矮身高學(xué)齡兒童有SHOX單倍體不足的可能性為12%（檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值）。更有趣的是，在身高110cm以上，肢體/軀干比例在1.95+1/2身高(m)之上的矮身高學(xué)齡兒童100%的沒(méi)有SHOX單倍體不足（陰性預(yù)測(cè)值）。但是（如5號(hào)病人），學(xué)齡前兒童以及矮于110cm的兒童，這個(gè)檢驗(yàn)有較低的敏感性和特異性，要小心應(yīng)用。

最后，本研究中的三名SHOX缺失淵源者以及其它以前檢出SHOX單倍體不足的5名病人常規(guī)左手腕X線片異常，表現(xiàn)出LWD的特征：遠(yuǎn)側(cè)橈骨三角形化（88%），遠(yuǎn)側(cè)排腕骨椎體化（88%）和橈骨的遠(yuǎn)側(cè)尺骨側(cè)透X光。因?yàn)槲覀兊倪z傳學(xué)方法未能檢測(cè)所有可能的SHOX缺失和SHOX點(diǎn)突變，所以我們?cè)跓o(wú)SHOX缺失淵源者組也分析了10名有最低肢體/軀干比例病人的手腕X線片。有趣的是，10名病人中有1名女性有輕微馬德隆畸形表現(xiàn)，可能是由于未檢測(cè)出的點(diǎn)突變，或是其它未知基因突變引起LWD。此外，10名病人中，2名兒童（3.8歲和5.5歲）屬于SHOX標(biāo)記僅有單一片段大小的5名病人組，他們的父母DNA不可提供信息或是沒(méi)有樣本。

討論

SHOX是影響生長(zhǎng)的重要基因，它的發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)問(wèn)題，該基因多大程度的突變貢獻(xiàn)于以前所診斷的特發(fā)性的矮身高。與特發(fā)性寬大的定義不同，最近的一個(gè)專(zhuān)家會(huì)議詳細(xì)定義了特發(fā)性矮身高，并由定義中排除了異常身體比例的兒童。定義的理論根據(jù)將寬大范圍的骨軟骨發(fā)育不良排除在特發(fā)性矮身高術(shù)語(yǔ)之外。但是，不要忘記，對(duì)矮身高所進(jìn)行的生長(zhǎng)學(xué)評(píng)價(jià)并不全面，常常為臨床觀察所代替，可能忽視輕微的骨不成比例。

本文結(jié)果與以前的未知病因特發(fā)性矮身高兒童常見(jiàn)SHOX突變的研究相一致，估價(jià)的發(fā)生率至少1-2%?？紤]到有一定百分?jǐn)?shù)的SHOX突變個(gè)體并非矮身高，SHOX突變的檢測(cè)尚不完全，總?cè)巳褐蠸HOX突變發(fā)生率至少為1：4000似乎是可靠的估計(jì)。因此， 很可能SHOX突變比成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR）3突變更為多見(jiàn)，估計(jì)軟骨發(fā)育不全的發(fā)生率在1：15000和1：40000之間，然而，F(xiàn)GFR3突變引起的軟骨發(fā)育不良和某些罕見(jiàn)的骨發(fā)育不全的發(fā)生率還不清楚。

因SHOX單倍不足有高發(fā)生率，所以確定及早診斷矮身高兒童的標(biāo)準(zhǔn)是重要的，特別是在證明了重組GH能有效促進(jìn)生長(zhǎng)的情況下。通過(guò)搜集所研究?jī)和械纳L(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)，我們觀察到，與陰性篩查結(jié)果相比，所有SHOX單倍體不足學(xué)齡兒童有明確的不成比例的臂和腿的縮短。其它研究者也觀察到了相似的SHOX單倍體不足所引起的骨不成比例，但是，因?yàn)樗械臏Y源者為L(zhǎng)WD家庭成員，他們搜集的數(shù)據(jù)有偏差。通過(guò)整合3個(gè)普遍使用的生長(zhǎng)學(xué)指標(biāo)，骨不成比例可定量為一項(xiàng)，我們稱(chēng)其為肢體/軀干比例，可直接將肢體長(zhǎng)度（坐骨下腿長(zhǎng)+臂展）與軀干長(zhǎng)度（坐高）相比較。我們的數(shù)據(jù)提示，在以身高調(diào)整的低肢體/軀干比例 [<1.95 + 1/2 height (m)] 矮身高學(xué)齡兒童中，SHOX突變的可能性約為12%。另一方面，正?；蚋叩闹w/軀干比例排除了SHOX突變。在身高低于110cm的學(xué)齡前兒童，這個(gè)規(guī)律是不可靠的，因?yàn)镾HOX單倍體不足引起的骨不成比例尚未充分地顯現(xiàn)。

最近，Rappold et al.報(bào)告了矮身高兒童的突變篩查，檢測(cè)出6名功能性SHOX突變。在4名有骨骼變形資料的兒童中，3名骨不成比例。但是，未列出身體比例的生長(zhǎng)學(xué)數(shù)據(jù)。在最早發(fā)現(xiàn)SHOX的報(bào)告中，兩兄弟攜帶無(wú)義突變，也并入本文中的受累對(duì)照組（5，6號(hào)病人）中。在6歲和8歲時(shí)他們最初被診斷為特發(fā)性矮身高。在一段時(shí)間內(nèi)，二者都出現(xiàn)了骨不成比例，完全符合LWD的診斷。因此，低年齡兒童的臨床診斷是困難的，特別是在骨不成比例尚未出現(xiàn)的學(xué)齡前兒童。就像在LWD家庭中一樣，所謂的特發(fā)性矮身高組中，男性較少（本研究中3名女性，無(wú)男性，參考文獻(xiàn)2中5名女無(wú)男），但兩篩查組中男性較多（56%和60%）。因此，其它研究中的女性發(fā)生率不是篩查偏差的問(wèn)題，而更可能是至今未知的基礎(chǔ)機(jī)制的結(jié)果。

除了生長(zhǎng)學(xué)外，由常規(guī)左手X線片形態(tài)學(xué)分析可以得出二線證據(jù)。雖然僅一名對(duì)照受累病人存在馬德隆畸形，但我們?cè)谒?名SHOX單倍體不足兒童檢查出了輕微LWD腕發(fā)育異常特征。橈骨遠(yuǎn)側(cè)尺側(cè)緣的透明是LWD引起腕異常的早期特殊征兆，但是僅出現(xiàn)于半數(shù)受累兒童之中。相比之下，在除一名年幼兒童外，所有SHOX單倍體不足兒童都存在橈骨三角形化和腕骨錐形化。Ross et al.發(fā)現(xiàn)，在SHOX單倍體不足的LWD家庭的42名淵源者中，僅有74%的受試者有類(lèi)似于馬德隆畸形的腕骨放射學(xué)異常。但是，在馬德隆畸形陰性的9名淵源者中，7名兒童的年齡在9歲以下。因此，他們的腕骨、橈骨骨化尚未達(dá)到能詳細(xì)進(jìn)行放射學(xué)評(píng)價(jià)的程度。Schiller et al.報(bào)告了SHOX單倍體不足成年人的馬德隆畸形的臨床和放射學(xué)表現(xiàn)，強(qiáng)調(diào)了兒童期馬德隆畸形的最初征兆，例如腕部楔形是X線唯一可檢測(cè)的特征?？傊?，絕大部分SHOX單倍體不足病人可能出現(xiàn)馬德隆畸形。兒童期放射學(xué)診斷的缺點(diǎn)是橈骨骺骨化尚不充分，在女孩骨齡9歲、男孩骨齡11歲才足以能夠診斷。因此，如果SHOX突變?yōu)榉峭耆笔У?，?yīng)當(dāng)進(jìn)行受累父母的放射學(xué)（臨床）分析。

結(jié)論，我們的遺傳學(xué)和臨床分析說(shuō)明，SHOX單倍體不足引起典型的骨不成比例和腕部異常，對(duì)絕大部分學(xué)齡兒童進(jìn)行詳細(xì)的生長(zhǎng)學(xué)和放射學(xué)分析即可鑒別。應(yīng)對(duì)肢體/軀干比例不足1.95 + 1/2 身高 (m)的矮身高學(xué)齡兒童進(jìn)行SHOX突變篩選。如果骨成熟度達(dá)到并有放射學(xué)經(jīng)驗(yàn)情況下，篩查目標(biāo)組可以進(jìn)一步縮小到有馬德隆畸形放射學(xué)征兆的兒童。SHOX單倍體不足表型類(lèi)似于所有程度的LWD，似乎比FGFR3突變引起的矮身高表型更為常見(jiàn)。

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